摘要
小核酸药物（反义寡核苷酸 ASO、小干扰 RNA siRNA 等）多以双链或可与靶标形成双链的结构形式发挥活性。反义链（AS）与有义链（SS）经分别合成与纯化后，须通过退火工序组装为双链活性形式。退火工序虽操作简便，却是决定双链纯度、收率与批间一致性的关键环节。本文从分子间作用本质出发，阐述退火过程的物理化学原理，系统梳理温度程序、链摩尔比、浓度、缓冲液与离子强度等关键工艺参数及其影响因素，并探讨其在质量属性界定与 CMC 控制策略中的要点，以期为小核酸药物的工艺开发与质量管理提供参考。
1 引言
小核酸药物的生产通常采用"分别合成—纯化—退火组装"的路线。反义链与有义链在固相合成（亚磷酰胺法）阶段即已完成磷硫骨架、糖环及碱基修饰等共价结构的构建；退火则是两条互补单链在溶液条件下经由非共价相互作用组装为双链的后段工序。由于退火过程不涉及化学反应，其结果高度依赖工艺条件的设置，且产物处于热力学平衡状态。业界实践中，退火常被视作"混匀加热再冷却"的简易操作，相关参数（尤其是降温速率）在工艺转移与放大时易被忽略，进而导致游离单链含量漂移、批间一致性下降等质量问题。因此，厘清退火的本质原理并系统识别其关键控制要素，对保障小核酸双链产品的质量具有重要意义。
2 退火过程的物理化学本质
2.1 非共价自组装，而非化学反应
退火是两条互补单链通过非共价相互作用组装为双链的过程，全程不涉及共价键的断裂或形成。AS 与 SS 的磷硫（PS）骨架、2′-糖修饰、碱基修饰在退火前后保持完全一致；双链与单链仅为同一化学实体在溶液中的不同空间排布。正因缺乏共价变化，退火过程完全可逆，受热力学平衡控制，其自发方向可由吉布斯自由能变化 ΔG = ΔH − TΔS 判定：双链态自由能低于单链态时，体系自发趋向双链组装。
2.2 主要驱动力
双链的形成与稳定并非由单一作用主导，而是多类非共价相互作用的协同结果。理解各作用的能量学来源，是合理设计退火条件（如温度、离子强度）的基础。
（1）碱基堆积（base stacking）。相邻碱基在平面方向上的 π-π 堆积与范德华相互作用，是双链稳定性的最主要焓来源。经典的"邻近碱基对（nearest-neighbor）热力学模型"（SantaLucia 等建立的统一参数集）即以相邻碱基对的堆积与配对能作为预测双链自由能的基本单元。实验证据表明，堆积作用对稳定性的贡献通常大于氢键：例如，即便在氢键被削弱或缺失的情形下，保持良好堆积的错配碱基对仍可表现出相当的稳定性；而单纯增加氢键数量（如 G-C 较 A-T 多一个氢键）对 Tm 的提升，在很大程度上也是通过改变局部堆积几何实现的。化学修饰对 Tm 的影响亦主要来自堆积与几何效应——锁核酸（LNA）因糖环 C2′–O2′ 桥连而"预组织"了堆叠构象，每个 LNA 碱基可使 Tm 升高约 3–8 °C；2′-O-甲氧乙基（2′-MOE）等则通过优化水合与构象提升亲和力。
（2）Watson-Crick 氢键。氢键决定碱基配对的特异性（A-U/T、G-C），是体系"识别"正确互补序列的基础；但其对双链稳定性的绝对能量贡献相对有限，且并非越高越好——错配若仍能维持局部堆积，氢键的缺失未必导致相应比例的失稳。氢键的主要作用是提供配对选择性，而非稳定性量级。
（3）疏水效应与反离子释放（熵驱动）。碱基属相对疏水的芳香平面，在水相中暴露时其表面会诱导周围水分子形成有序排列（熵减）；当两条链通过堆积相互掩蔽疏水表面后，这部分有序水被释放，体系熵增，提供重要的稳定驱动力。此外，两条带大量负电荷的磷酸骨架在溶液中各自"凝聚"着一层抗衡离子（Na⁺、Mg²⁺ 等，即 Manning 反离子凝聚理论所述的凝聚层）。双链形成使两条多聚阴离子靠近，伴随大量抗衡离子的释放，这一去溶剂化/反离子释放过程贡献了显著的 favorable 熵变，也解释了离子强度（尤其是二价阳离子）对 Tm 影响极大的现象。
综合来看，双链稳定性可由 ΔG = ΔH − TΔS 描述：在熔解温度 Tm 处 ΔG = 0，低于 Tm 时双链态自由能更低、热力学占优。堆积提供主要负 ΔH，疏水效应与反离子释放提供主要正 ΔS，氢键则主要贡献配对选择性。退火工艺的核心，正是通过控制温度与离子强度，使体系在降温过程中落到正确的热力学稳定态。
2.3 对修饰型寡核苷酸的适用性
磷硫骨架替换、2′-O-甲基、2′-O-甲氧乙基（2′-MOE）、锁核酸（LNA）等常见修饰，改变的是双链的热力学参数（Tm、ΔG）与退火动力学（如 LNA 通过预组织糖环提升亲和力），但并未改变退火作为非共价自组装的本质。换言之，修饰影响"双链形成的难易与稳定程度"，而不改变"退火仅为物理组装"这一性质。
3 关键工艺参数与影响因素
需说明，本文所述的"退火"作为独立的后段制造工序，主要适用于 RNA 干扰/基因沉默谱系的双链型模态（siRNA、miRNA mimic、antagomir、saRNA 等），其活性形式由反义链（AS/guide）与有义链（SS/passenger）两条互补链组装而成。反义谱系（ASO、PMO）与适配体等为单链分子，合成纯化后不经双链组装；但其与靶标 RNA 在细胞内形成杂合双链的作用本质，同样遵循本节所述的非共价热力学原理。以下以双链型模态的退火工序为对象展开阐述。
3.1 温度程序
温度程序是退火最敏感的工艺变量，由变性（解链）与复性（组装）两个阶段构成。
变性阶段：通常将混合溶液加热至 90–95 °C 并保温数分钟。其目的并非"熔化双链"（此时尚为单链），而是打散每条单链自身预存的二级结构（发卡、G-四链体、自互补二聚体），确保起始为构象均一的单链，避免其参与错配或阻碍正确退火。对于含 LNA、高 GC 含量或长序列的修饰寡核苷酸，单链自身结构的稳定性更高，必要时需提高变性温度或延长保温以确保完全解链。
复性（降温）阶段：降温速率直接决定产物是落向热力学最稳的正确双链，还是被"冻结"于动力学陷阱。缓慢降温（经验上约 0.1–2 °C/min，或分段台阶降温至 4–25 °C）给予体系充分的构象弛豫时间，使碱基逐步找到最优堆积与配对；降温过快（如直接置室温自然冷却且体系体积较大、散热不均）则易将错配、次优配对或单链残留结构锁定，表现为游离单链与错配双链含量升高、批间波动。对于 siRNA，正确的引导链/乘客链选择性还依赖于双链两端的热力学不对称性（引导链 5′端更稳定），退火温度曲线不当会削弱该选择性，影响后续 RISC 加载效率。
3.2 链摩尔比
两条链通常按 1:1 等摩尔投料。以单侧链轻微过量（如 1.0–1.2:1），可在热力学上推动限制链被完全消耗、提高双链收率；但过量侧的链将以游离单链形式残留，构成工艺杂质，须依赖下游纯化（如 HPLC 分离）去除。因此链摩尔比须与下游纯化能力统筹设定，并在批记录中明确投料计算与接受标准。对于非对称双链（如引导链与乘客链长度不同、或一端带 2-nt 悬垂、GalNAc 偶联于有义链 3′端），仍须基于摩尔数而非质量数配平。此外，两条链的身份核对（AS/SS、sense/antisense 混淆）是投料环节的真实风险点，需在物料接收与投料前进行序列确证。
3.3 浓度
退火为双分子（或多分子）缔合过程，总链浓度影响动力学与收率：浓度越高，链间碰撞频率越高、退火越快，有利于缩短周期与提高收率；但过高的浓度可能促进分子间非特异性聚集（尤其对于硫代磷酸（PS）骨架等疏水/强结合体系）及 off-pathway 错配。工艺上常用约 0.1–1 mM 的总浓度区间，并常先在低/中盐退火缓冲液中进行，再经脱盐/缓冲液置换转入制剂缓冲体系。具体浓度应结合规模、设备混匀能力与下游纯化负荷确定。
3.4 缓冲液与离子强度
阳离子通过屏蔽磷酸骨架间的静电斥力，是双链形成的必要条件。单价阳离子（Na⁺、K⁺）在约 10–100 mM 范围内即可显著稳定双链；二价阳离子（Mg²⁺）因更高的电荷密度与桥联能力，对双链（尤其含结构或自互补序列）的稳定作用远强于单价离子，但 Mg²⁺ 同时也会稳定错配与单链二级结构、并可能促进聚集，使用须谨慎且通常限于低 mM 或仅在必要时引入。溶液 pH 维持中性偏碱，以避免酸性条件去嘌呤、强碱条件骨架水解；并常辅以 EDTA 螯合金属离子，抑制加热段的金属催化降解与氧化。需注意的是，退火缓冲液常与最终制剂缓冲液不同，退火后须进行脱盐或缓冲液置换，并将离子组成作为变更控制对象。
3.5 时间与平衡
除升降温外，变性保温时间与低温端平衡停留时间决定体系是否达到稳态双链占比。保温不足或降温后平衡不充分，双链形成率将未达平台，造成批间差异。工艺开发中可通过熔解曲线确认双链占比是否随平衡时间趋于恒定，从而确定最小必要的停留时间。
3.6 设备与放大效应
实验室至中试多采用水浴、PCR 仪或控温冷柜进行批式退火；商业化生产多采用夹套罐程序控温，或连续流过热交换器（以停留时间间接控制退火程度）。规模放大时，传热与混匀均匀性的改变会显著改变有效升降温曲线：例如大体积罐内的"自然冷却"实际降温速率远低于小体积 PCR 管，且罐内温度分布不均，导致不同部位退火程度不一致。因此，降温速率等参数在工艺转移时须以可量化的控温斜率或有效驻留时间来规定，并经规模桥接（scale-down/scale-up bridging）研究确认等效性，而非沿用"自然冷却"等定性描述。
3.7 上游单链质量
退火产物的质量上限由单链本身决定，主要体现于两方面：
一是单链化学纯度。 偶联失败或过早截断产生的 n−1、n+1、缺失/插入序列，脱保护不完全产生的碱基缺失/加合、abasic 位点，以及硫代磷酸的氧化产物等，在退火后直接转化为双链杂质；修饰（尤其全 PS）引入的 Rp/Sp 立体异构体混合物虽不显著改变碱基配对，但增加表征与批间一致性难度。
二是序列自身的结构倾向。 自互补、长 GC 发卡、G-四链体（G-rich 序列）等 off-pathway 结构，会在退火阶段即与正确双链争夺组装，是游离单链与错配双链的重要来源。此类因素须在序列设计与单链质量控制阶段评估与管控，单靠退火段参数调整往往难以弥补。
4 质量属性与控制策略
4.1 关键质量属性
退火工序的主要质量属性包括：双链形成率/收率、游离单链含量、Tm 与熔解曲线、以及错配/次优双链比例。需特别指出的是，游离单链与双链化学同源，无法通过退火本身去除，须作为工艺杂质纳入控制。
4.2 分析方法
游离单链及双链组成可经毛细管电泳（CE）、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）或高效液相色谱（HPLC）进行分离与定量；熔解曲线则用于评估 Tm 及批间一致性。同一序列不同批次 Tm 的漂移，往往提示退火条件或上游单链质量存在变异。
4.3 CMC与工艺控制要点
- 参数分级：温度程序（尤其降温速率）与链摩尔比宜列为关键工艺参数（CPP）管理；升温保温与平衡时间作为重要工艺参数（IPP）。
- 放大转移：降温速率在实验室向商业化转移时最易丢失，须以量化指标（如控温斜率、有效驻留时间）明确，而非"自然冷却"等定性描述。
- 储存裕度：鉴于退火可逆，成品储存温度应显著低于 Tm，防止长期储存中双链解离、游离单链回升。
- 下游衔接：退火后通常衔接脱盐/缓冲液置换，并按需经色谱纯化去除游离单链与错配双链。
- 体系依据：相关质量标准、稳定性与可比性研究可参照 ICH Q6A（质量标准）、ICH Q1A（稳定性）、ICH Q5E（制造工艺变更的可比性）以及《药品生产质量管理规范》等要求，建立完整的控制策略。
5 退火工艺不当引发的典型问题
如前所述，退火是受热力学控制的非共价自组装过程，产物状态完全由工艺条件决定，缺乏化学反应的"自校正"能力。这意味着一旦温度、链摩尔比、浓度、缓冲液等参数设置不当，缺陷将直接、成比例地体现在产品质量上，且无法通过退火本身弥补。以下按质量影响的逻辑层次，归纳工艺不当可引发的典型问题。
5.1 双链收率不足与游离单链杂质升高
变性不充分（温度偏低或保温时间不足）使单链保留发卡、G-四链体或自互补二聚体等预存结构，阻碍正确配对，导致双链形成率下降；浓度过低则使双分子缔合动力学变慢、收率不足。链摩尔比偏离 1:1（限制链投料不足，或过量侧未能经下游去除）则直接产生游离单链。
游离单链是退火工序的头号工艺杂质，其与双链化学同源，退火过程本身无法将其去除。其影响具有双重性：一是活性下降，因通常仅正确双链具备预期的 RNAi 或 RNase H 介导活性，游离链无活性或活性低下；二是安全性风险，游离引导链可独立加载入 RISC 产生脱靶沉默，游离乘客链则与之竞争，二者均可能改变预期的药效/安全边界。故游离单链含量须作为关键质量属性，经 CE、native PAGE 或 HPLC 监控并设限度。
5.2 错配/次优双链与链选择性偏移
降温过快、序列自身 off-pathway 结构竞争，或退火缓冲液/温度窗口不当，会使错配双链、非预期杂合双链或单链残留构象被"冻结"于动力学陷阱。此类错配双链作为独立杂质，其活性与毒性谱不同于正确双链，须通过下游纯化去除并设接受标准。
对 siRNA 而言还存在链选择性问题：正确的引导链/乘客链判别依赖于双链两端的热力学不对称性（引导链 5′端更稳定）。若退火温度曲线不当，削弱了该不对称性，乘客链可能被优先加载入 RISC，导致目标 mRNA 沉默效率下降、脱靶风险上升。这是"工艺条件—活性—安全性"链条上的关键节点，亦解释了为何退火不应被视为可随意简化的步骤。
5.3 批间一致性与规模放大失效
退火参数尤其是降温速率，若仅以"自然冷却"等定性描述规定，其实际有效值将随体系体积、容器材质、混匀方式大幅变化。实验室小体积 PCR 管与商业化大体积夹套罐的有效降温曲线可相差数倍乃至数量级；大体积罐内温度分布不均，还可造成批内异质性（不同取样点双链占比不同）。其后果是 Tm 与游离单链含量的批间漂移，进而干扰稳定性评估与可比性研究（ICH Q5E），若为临床样品，还可能影响给药剂量的准确性。
5.4 聚集、颗粒与化学降解风险
浓度过高、Mg²⁺ 过量或缓冲液组成不当，可诱发分子间非特异性聚集，产生可见或不溶性微粒。对注射剂而言，不溶性微粒（尤其亚可见微粒）属关键质量属性，与栓塞、免疫原性等安全性风险相关。另一方面，退火缓冲液 pH 偏离中性（酸性致去嘌呤、碱性致骨架水解）或缺 EDTA 而致金属离子未被螯合，会在加热段被放大，引入碱基缺失、硫代磷酸氧化等降解产物，进一步恶化杂质谱。
5.5 对下游纯化、稳定性与可比性的连锁影响
上述问题将对产品全生命周期产生连锁效应。其一，游离单链与错配双链升高加重下游纯化负荷，降低总收率、增加物料与成本，并可能挤压临床供应连续性——失败批次可直接导致临床中断。其二，退火形成的双链若未处于最优热力学态，其有效 Tm 低于设计值，在长期储存（尤其储存温度接近 Tm 时）易解离、游离单链回升，影响有效期与储存条件设定（ICH Q1A 稳定性研究）。其三，退火作为关键工序，其参数若未明确定义为 CPP 并纳入变更控制，任何"看似微小"的调整（如冷却方式改变）都可能静默改变产品质量，在工艺变更可比性（ICH Q5E）与监管申报中构成风险。
综上，退火工艺的稳健性直接决定双链产品的纯度、收率、批间一致性与临床适用性。在工艺开发中尽早开展退火参数窗口研究，并将关键参数与上游序列设计、下游纯化及稳定性考察统筹管控，是规避上述问题的根本途径。
6 结语
退火是小核酸双链产品生产中的关键工序，其本质是受热力学控制的非共价自组装过程，而非化学反应。工艺控制的核心，在于通过温度程序、链摩尔比与溶液环境等参数将体系导向正确的热力学稳定双链，并将游离单链等杂质纳入质量属性管理。建议在工艺开发早期即开展退火参数窗口研究，并将关键参数与上游序列设计、下游纯化及稳定性考察统筹考虑，以保障双链产品的质量与批间一致性。
参考文献
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