1.1质粒的开发流程
种子制备(菌种库)-发酵-菌体收获-碱裂解-澄清(过滤或者离心)-超滤浓缩(提高质粒浓度)-层析(阴离子)-层析(疏水)-浓缩-除菌-灌装
1.2 质粒上游发酵工艺
发酵工艺每个公司大同小异,在此就不讨论。主要的内容包括:菌种构建/筛选;RCB生产曲线,传代稳定性(还有啥?非专业请补充)
1.3质粒下游纯化工艺
其中纯化工艺有两种,GE工艺和BIA工艺。
GE工艺,进行了三次层析,包含:
凝胶过滤层析-目的去除宿主残留
疏水层析-提高超螺旋质粒含量纯度
阴离子交换层析-去除内毒素
BIA工艺,进行两次层析,包含:
阴离子交换层析-去除内毒素和RNA
疏水层析-提高质粒纯度含量
BIA工艺的阴离子交换可以同时去除内毒素和宿主残留RNA,但是RNA清除效果不如GE工艺的三次层析。
1.4 质粒的质量控制
工艺开发阶段的质粒质量控制检项如下
检测类别 | 检测项目(PD同GMP) |
---|---|
常规 | 外观 |
常规 | pH(临床前研究无) |
纯度 | A260/A280比例 |
纯度 | 质粒DNA浓度 |
纯度 | 超螺旋百分比 |
纯度 | 残留宿主蛋白(临床前研究无相关检项) |
纯度 | 残留宿主DNA |
纯度 | 残留宿主RNA |
外源污染 | 内毒素试验< 10EU/mg |
外源污染 | 无菌试验(临床前研究无) |
质粒检定 | 限制性酶切 |
质粒检定 | 测序 |
1.5菌种库的管理
研发过程中需要进行管理的菌种类型包含:
感受态细胞;克隆菌种;PCB;客户菌种
PCB的管理要求是最高的,生产用的WCB来源于PCB。
1.5.1菌种的接收
- 接收过程中检查包装外观是否完整,送货单随货文件是否齐全;
- 记录接收日期,如有温度监控,温度监控记录(或接收时温度)应当记录/保存;
- 接收时注意核对标签信息与送货单是否一致;
- 接收过程中发现异常应当及时与供应商沟通,必要时应当拒签。
1.5.2菌种的保存
- 未检测和检测合格的应该分区存放;
- 存放于超低温冰箱,如有条件可以双人双锁(对于PCB),MCB和WCB必须双人双锁;
- 专人管理;
- 温度监控;
- 菌种的存取应当有相应的记录。
1.5.3菌种的销毁(PCB)
- 以下一些情况,可以考虑菌种的销毁
存储不当;
超过效期;
无保存价值。
- 销毁应当经过审批,如为客户菌种,还需要客户签字同意
- 菌种销毁应当灭活处理,121℃,40min或其他彻底灭活条件。
1.5.4菌种库的质量控制
一般需要进行以下检测
检测项 | 一般标准 | |
---|---|---|
MCB/WCB甘油菌菌库 | 菌体活率 | > 1.0×107CFU/mL |
MCB/WCB甘油菌菌库 | 细菌和真菌 | 阴性 |
MCB/WCB甘油菌菌库 | 革兰氏染色 | 革兰氏阴性菌,红色短杆状 |
MCB/WCB甘油菌菌库 | 噬菌体检测 | 阴性 |
MCB/WCB甘油菌菌库 | 纯度检测 | TAS、SDA平板无其他杂菌生长 |
稳定性试验 质粒 | 质粒产量变异系数 | ≤ 25% |
稳定性试验 质粒 | 质粒保有率 | ≥ 80% |
稳定性试验 质粒 | 酶切 | 片段大小应与理论相符 |
稳定性试验 质粒 | 全序列测序 | 序列与理论相符 |
稳定性试验 质粒 | 超螺旋含量 | > 90% |