病毒载体/抗体的制备需要一个稳定、连续的生产工艺，细胞库具有良好的均质性，且经过充分的质量鉴定，从而最大限度地控制污染风险，可以为研发生产提供质量相同、遗传稳定的细胞来源，以确保研发注册阶段病毒载体生产的稳定性和可靠性。研发过程中频繁用到各类细胞，但是并不是所有的细胞都需要建库并按照细胞库管理。只有那些需要建库用于检测或者后续用于生产的细胞才需要按照细胞库的管理要求进行管理。Q：PBMC如何管理（原材料）-基因与细胞治疗研发物料的管理1细胞库的三级管理细胞库分为三级管理，即初级/原始细胞库、主细胞库和工作细胞库。如为引进的细胞，可采用主细胞库和工作细胞库组成的二级细胞库管理。在某些特殊情况下，也可采用细胞种子和主细胞库二级管理，但需要得到国务院药品监督部门的批准。1.1初级细胞库（pre-master cell bank）又名细胞种子（cell seed）和原始细胞库 (Primary Cell Bank，PCB), 由一个原始细胞群体发展成为传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养形成的均一细胞群体，通过检定证明（具体检定项目要求见表1和表2）适用于生物制品生产或检定。在特殊条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液，定量均匀分装于安瓿或适宜的细胞冻存管，于液氮冻存，即为原始细胞库，供建立主细胞库用。1.2主细胞库(Master Cell Bank，MCB)原始细胞库细胞传代增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或-130℃以下。这些细胞须按其特定的质控要求进行全面检定（（具体检定项目要求见表1和表2）），全部合格后即为主细胞库，供建立工作细胞库用。主细胞库的质量标准应高于初级细胞库。生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。1.3工作细胞库(Working Cell Bank，WCB)经主细胞库细胞传代增殖，达到一定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或一130°C以下备用，即为工作细胞库。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。复苏后的传代的水平应不超过批准的该细胞用于生产的最高限定代次，最高限定代次应根据研究结果确定，不得超过国际认可的最高限定代次。工作细胞库的质量标准应在主细胞库的质量标准基础上建立。生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。2细胞库构建原始细胞库一般由研发构建，用于主细胞库的构建。主细胞库和工作细胞库应在B级背景下的A级洁净等级下分离或制备后获得，建库过程中操作人员不得在同一区域同时处理不同活性或具有传染性的物料，如病毒、细胞系、细胞株。建立每个细胞库均应有相应的建库记录，记录细胞来源，何时复苏，传代具体信息，何时冻存，冻存细胞批号，冻存的细胞代次，冻存数量。每个库的细胞冻存后，应抽取其中可代表冻存全过程的细胞进行复苏，检查有无染菌，复苏后细胞活力应大于80%。3细胞库的管理要求细胞接收应当保留相应的证明文件（营业执照/合同/发票/背景资料（来源和培养历史）/COA/报关单/操作手册等），未检测和经过检验的细胞应该分开存放,防止交叉污染。接收过程中应当检查送货单与采购订单信息是否一致，细胞的标识是否清晰完整，包装物信息与供应商提供的质量文件是否一致，运输温度是否满足要求。应当详细记录细胞建库的过程，包括细胞建库过程中使用的所有原材料，以及细胞传代和冻存的过程。冻存的细胞存活率须在90％以上（特殊细胞视具体情况而定）。冻存后的细胞，应至少做一次复苏培养并连续传代至衰老期，检查不同传代水平的细胞生长情况。在指定人员的监督下，经批准的人员方可进行细胞库操作，未经批准不得接触细胞库。需要双人双锁管理，出入应当经过适当的流程批准。贮藏容器应当在适当温度下保存，并有明确标签，冷藏库应有连续温度记录（液氮不需要），应定期检查液氮罐内液氮量并及时补加，液氮保藏区温湿度、大气压、氧分压、电力供应这些指标应做好记录，任何偏离贮存条件的情况及纠正措施都应记录。市场上有很多智能化控制的液氮罐，有助于细胞存储环境的实时监控等，提高工作效率和安全性。存储容器应当有使用和维护记录。每种细胞库均应分别建立台账，记录放置位置、容器编号、贮存数量和取用记录，确保储存细胞在储存期间能被准确找到。（研发也一样，每个细胞库应当有独立的台账，方便查找。可建立细胞冻存位置图，细胞出入台账）贮存期间的主细胞库和工作细胞库中的细胞一旦取出，不得再返回库内贮存。主细胞库和工作细胞库贮存条件应当一致，检定和生产用各级细胞库应分不同液氮罐贮藏，且生产用每一个库应 在生产设施内至少2个不同地点或室或有明显标志分隔的区域存放（异地备份）。非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。细胞的标签一般应包含 （细胞名称/细胞代次/活率/批号/冻存日期/瓶号等信息）检定用细胞（非生产）如果用量较少，可以只建立单一主细胞库。但是为了保证检测结果的准确性，限定从主库中取出的细胞最高传代20代。4细胞库的检验 各类细胞的检验 细胞库检测项目细胞检定一般包含以下几个方面：鉴别、外源因子污染、内源因子、致瘤性检测等。建立细胞库的实验室应至少进行一次MCB细胞的全面检定，检定应包括：细胞鉴别试验，细菌、真菌检查，支原体检查，外源病毒因子检查等。每次建立WCB后，均应按规定项目进行检定。4.1细胞鉴别细胞鉴别试验方法有多种，包括细胞遗传检测(如特征染色体标志)、遗传标志检测(如DNA指纹图谱、STR图谱、基因组二核苷重复序列)、免疫学检测(如组织相容性抗原、种特异性抗血清)和生物化学鉴别法(如同工酶试验)等。可选其中一种或几种方法，但均须经国家药品检定机构认可。细胞表型特征与遗传学特征相结合来判断，更有利于细胞鉴别。4.2细菌、真菌检查（无菌检查）取细胞培养上清液样品进行检查4.3支原体检查取细胞培养上清液样品进行检查，应为阴性4.4细胞內、外源病毒因子检查外源病毒污染检查：采用《中国药典》（三部）通则“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”中“体外不同指示细胞接种培养法检测病毒因子”项及“动物和鸡胚体内接种法检测外源病毒因子”项检查，应无外源病毒污染。 内/外源病毒污染检查 项目分类 检测项目 服务说明 项目分类 体外法 细胞形态观察及血吸附试验 牛源病毒检测 CPE、血吸附试验、免疫荧光 体外不同细胞接种培养法 检测病毒：BVDV、PI3、BAV-3、REO-3、BPV 体内接种法 鸡胚、成年小鼠、乳鼠、豚鼠、家兔 猪源病毒检测 猪细小病毒 逆转录病毒检测 逆转录酶活性、透射电镜法、感染性试验、PCR法或其他特异性体外法 其他特异种属病毒检测-鼠源 检测病毒：MVM, Hantavirus, Reovirus, LCM, Sendai virus, Ectromelia virus, Adenovirus, Mouse Pneumonia Virus, MLV 其他特异种属病毒检测-人源 检测病毒：EB, HCMV, HIV-1/-2, HTLV-1/-2, HAV, HBV, HCV, B19, HHV-6/-7/-8, HSV-1/-2 4.5致瘤性检查致瘤性（Oncogenicity）检查是保证在细胞里不存在可以使细胞永生化或者具有形成肿瘤的因子(间接作用，非细胞本身成瘤)。检测项目考虑要点致瘤性检查新型细胞基质，特别是成瘤性为阳性的细胞，用于疫苗生产时，需检测致瘤性。以下细胞不要求进行致瘤性检查：CHO、NS0、Sp2/0、低代次Vero细胞MRC-5、2BS、KMB17、WI38及FRhL-2细胞4.6其他成瘤性（Tumourigencity）检查：是看这个细胞机制在动物体内是否能形成肿瘤，是对细胞特性的一个鉴定。检测过程中所用的阳性对照细胞应具有成瘤性。检测项目考虑要点成瘤性检查新建细胞系/株应进行成瘤性检查；已证明具有成瘤性的传代细胞不再做成瘤性检查，如：BHK21、CHO、HEK293、C127、NS0、杂交瘤细胞等注：成瘤性和致瘤性的区别是致瘤性是细胞内存在某些因子间接使细胞形成肿瘤，而成瘤性是细胞本生的特性。虽然成瘤性高的细胞沉淀中DNA的致瘤性高于非成瘤性细胞来源的DNA，但是关于细胞的成瘤性和其DNA的致瘤性之间的关系还不得而知。病毒敏感性检查：用于检测活疫苗制品病毒滴度的细胞，应进行此项检查，证明所用细胞具有足够的相应病毒敏感度。细胞功能检查：用于生物学活性、效力或者效价测定的细胞，应进行此项检查，证明所用细胞能够有效评价待检样品质量。检定用细胞至少进行4.1-4.3项目的检查参考文献：[1]中国药典2020[2]USP 1042 cell banking[3]ICH Q5D[4]钟鼎生物 https://www.zoonbio.com/protein/cell-bank-testing-service.html ; https://www.zoonbio.com/protein/cell-bank-method.html
病毒载体广泛应用于细胞治疗、基因治疗、病毒疫苗三大领域，用于将目的基因携带进入靶细胞从而实现对基因的修饰作用，表达目的蛋白，以治愈疾病。[1] GE生命科学-病毒载体工艺开发-谈具体参数？No！我们谈思路！2.1工艺简介2.1.1包装系统目前常用的慢病毒（LV:Lentivirus）工艺开发采用四质粒系统（第三代包装系统），相比于第二代的三质粒系统，病毒的安全性进一步提升，减少重组成复制型病毒(RCV) 的可能性。四质粒分别的作用：一个具有目的基因的慢病毒表达质粒。表达质粒包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。目的基因两侧各有一个LTR（long terminal repeat）序列，LTR序列促使目的基因整合到目的细胞基因组里。为了提高安全性能，表达质粒的3’LTR缺失了部分序列，使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。两个包装质粒。其中一个质粒编码Rev，另外一个质粒编码Gag和Pol。一个编码包膜蛋白的质粒。将上述4个质粒共转染细胞。转染用的细胞常用293表达系统，且常采用瞬转工艺。区别于稳转工艺，瞬转系统在每次生产病毒时都需要重新进行病毒的包装，不会对已经感染病毒的293细胞建库。2.1.2病毒生产方式当前有两种广泛使用的首选病毒载体生产方式。多数研究者采用瞬时转染，或者在哺乳动物或昆虫细胞中获得稳定的生产细胞系。大部分瞬时转染载体的生产使用贴壁依赖性细胞系，其中所选细胞类型需要有利于它们附着、生长和生产病毒载体的表面。另一方面，稳定生产的细胞系通常是适应悬浮的细胞系，不需要基质附着、生长和生产病毒载体。这两种病毒载体生产方式各有优缺点。因此，需要在临床开发的早期就要确定目标剂量和患者群体，以指导选择最优载体生产平台，从而满足未来的商业化需求。。[2] 病毒载体生产的上游生物工艺2.1.2.1瞬时转染载体瞬时转染载体优点：瞬时转染涉及将遗传物质插入细胞中，而不需要将遗传物质整合到宿主细胞基因组中，该过程在操作上相对简单和直接。它还受益于以下因素：转染的遗传物质在细胞内停留的时间有限，并且不会转移至其他新的分裂细胞中。采用该工艺生产的病毒载体在转染后较短时间内就可以从细胞中收获。与稳定的生产细胞系相比，基于瞬时转染的病毒生产相关的工艺开发时间相对较短。生物制药行业已经有多家成熟的供应商，拥有高效瞬时转染类载体生产需要的各种工具。但是，使用稳定的生产细胞系的载体生产方法还相对较新，并且正在进行支持行业不断增长的需求的工作。瞬时转染是一种非常灵活和高效的病毒载体生产方法，它可以缩短开发时间并加速上市时间。瞬时转染载体缺点：它需要昂贵的GMP级质粒用于转染步骤，以及用于清除辅助质粒、细胞DNA和转染试剂的其他纯化步骤。2.1.2.2 稳转细胞系稳转细胞系经过基因修饰，通过诱导型启动子表达辅助基因、包装基因以及目标基因，用于生产病毒载体。稳转细胞系可以通过避免多质粒转染步骤简化病毒载体生产步骤，通过避免使用昂贵的cGMP质粒降低成本，通过生成历史清晰的细胞系最大程度地降低管控要求。当前已获批或处于临床阶段后期的基因疗法，主要聚焦于治疗罕见的遗传疾病，其中目标患者人群数和每剂量的病毒颗粒的需求量相对较小。但是，老年痴呆症、帕金森症、类风湿性关节炎和血友病等疾病治疗的商业化面临巨大生产挑战，这是因为每剂量的病毒颗粒数会显著增加（对数级），并且患者人数也会更多。治疗此类疾病需要更多的病毒剂量和更高的病毒滴度，预计稳转细胞系的开发会显著提高病毒载体生产能力，满足这些疗法所需要的条件和规格。稳转细胞系的开发可能需要较长的时间，这会增加上市时间。但是，一旦该细胞系经过工程改造和克隆可以达到更高的细胞密度和病毒载体滴度，该工艺最终会实现更高的生产效率并具备可扩展性。许多公司正在积极开发设计人源细胞系，使其适合在悬浮培养的无血清培养基中生长。希望向稳定的人源生产细胞系的转变将减少管控安全问题，并通过提供糖基化修饰方式提高病毒载体在人体内的稳定性。[3] 用于病毒载体生产的上游生物工艺（第2部分）2.2工艺流程病毒载体的生产工艺包括上游+下游两个部分。其中上游工艺的主要目的是为了得到一定滴度的病毒料液，而下游的主要目的是为了得到高滴度+高纯度的病毒载体来保证载体的效率和安全性。[4] GE生命科学-病毒载体工艺开发-谈具体参数？No！我们谈思路病毒工艺开发流程图1注:根据病毒在细胞中的定位不同，习惯上可以将病毒载体大致分为裂解型病毒（如 LV 等）和非裂解型病毒（如 AAV、AdV 等）。裂解型病毒包装完成后自行裂解细胞，释放到培养基中，收获含有病毒载体的细胞培养液即开始进行下游纯化；而非裂解型的病毒在进行下游纯化之前需要先进行细胞裂解，常用的技术为：反复冻融法和去垢剂法。收获后的含有病毒载体的料液在进行层析或者超滤之前，一般都会经历核酸酶处理的步骤来降解大分子核酸物质，此过程的关键参数包括核酸酶浓度、反应温度、反应时间等。病毒工艺开发流程图22.3病毒的检测2.3.1 纯度杂质1) 总蛋白2）牛血清白蛋白检测3）Benzonase-工艺开发过程酶切残留4）宿主蛋白残留5）宿主DNA残留6）残留质粒7）SV408) E1A2.3.2滴度1)感染滴度2)病毒总颗粒2.3.3安全性1)无菌检测2)细胞内毒素3)支原体4)RCL(具有复制能力的慢病毒ReplicationCompetentLentivirus)2.3.4其他检测1)pH值2)外观TBC
1.1质粒的开发流程种子制备（菌种库）-发酵-菌体收获-碱裂解-澄清（过滤或者离心）-超滤浓缩（提高质粒浓度）-层析（阴离子）-层析（疏水）-浓缩-除菌-灌装1.2 质粒上游发酵工艺发酵工艺每个公司大同小异，在此就不讨论。主要的内容包括：菌种构建/筛选；RCB生产曲线，传代稳定性（还有啥？非专业请补充）1.3质粒下游纯化工艺其中纯化工艺有两种,GE工艺和BIA工艺。GE工艺，进行了三次层析，包含:凝胶过滤层析-目的去除宿主残留疏水层析-提高超螺旋质粒含量纯度阴离子交换层析-去除内毒素BIA工艺，进行两次层析，包含：阴离子交换层析-去除内毒素和RNA疏水层析-提高质粒纯度含量BIA工艺的阴离子交换可以同时去除内毒素和宿主残留RNA，但是RNA清除效果不如GE工艺的三次层析。1.4 质粒的质量控制工艺开发阶段的质粒质量控制检项如下检测类别检测项目（PD同GMP）常规外观常规pH（临床前研究无）纯度A260/A280比例纯度质粒DNA浓度纯度超螺旋百分比纯度残留宿主蛋白（临床前研究无相关检项）纯度残留宿主DNA纯度残留宿主RNA外源污染内毒素试验< 10EU/mg外源污染无菌试验（临床前研究无）质粒检定限制性酶切质粒检定测序1.5菌种库的管理研发过程中需要进行管理的菌种类型包含：感受态细胞；克隆菌种；PCB；客户菌种PCB的管理要求是最高的，生产用的WCB来源于PCB。1.5.1菌种的接收接收过程中检查包装外观是否完整，送货单随货文件是否齐全；记录接收日期，如有温度监控，温度监控记录（或接收时温度）应当记录/保存；接收时注意核对标签信息与送货单是否一致；接收过程中发现异常应当及时与供应商沟通，必要时应当拒签。1.5.2菌种的保存未检测和检测合格的应该分区存放；存放于超低温冰箱，如有条件可以双人双锁（对于PCB），MCB和WCB必须双人双锁；专人管理；温度监控；菌种的存取应当有相应的记录。1.5.3菌种的销毁（PCB）以下一些情况，可以考虑菌种的销毁存储不当；超过效期；无保存价值。销毁应当经过审批，如为客户菌种，还需要客户签字同意菌种销毁应当灭活处理，121℃，40min或其他彻底灭活条件。1.5.4菌种库的质量控制一般需要进行以下检测检测项 一般标准MCB/WCB甘油菌菌库菌体活率> 1.0×107CFU/mLMCB/WCB甘油菌菌库细菌和真菌阴性MCB/WCB甘油菌菌库革兰氏染色革兰氏阴性菌，红色短杆状MCB/WCB甘油菌菌库噬菌体检测阴性MCB/WCB甘油菌菌库纯度检测TAS、SDA平板无其他杂菌生长稳定性试验 质粒质粒产量变异系数≤ 25%稳定性试验 质粒质粒保有率≥ 80%稳定性试验 质粒酶切片段大小应与理论相符稳定性试验 质粒全序列测序序列与理论相符稳定性试验 质粒超螺旋含量> 90%